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Tercera parte : Explicación de la tolerancia

Por Rémy Vandame1.2, Marc Colin1 y Gabriel Otero Colina2

Mientras el uso de moléculas de síntesis comprueba sus límites en la lucha contra el ácaro Varroa jacobsoni, siguen las investigaciones fundamentales sobre la biología de este ácaro. Su objetivo es determinar y explotar los puntos sensibles del desarrollo de Varroa. Sólo tales investigaciones permitirán desarollar una técnica de lucha contra Varroa, a la vez eficaz, de largo plazo, y respetuosa de las abejas y de sus productos.

En este enfoque de investigación fundamental, empezamos un trabajo en colaboración con el Colegio de Postgraduados, en México. En este país coexisten abejas europeas, sensibles a Varroa, y abejas africanizadas, tolerantes a Varroa. El objetivo de nuestro trabajo fue comparar la dinámica de poblaciones de Varroa en colmenas de abejas europeas y en colmenas de abejas africanizadas.

Proporcionamos aquí, en un artículo en tres partes, de cuales dos fueron publicadas anteriormente, los resultados de nuestros trabajos. En la primera parte, hemos presentado datos recientemente adquiridos sobre la biología de Varroa, entre otros sobre su ciclo de reproducción. En la segunda parte, hemos presentado el principio de nuestro trabajo en México, donde comprobamos los periodos y intensidades a los cuales aparece la tolerancia de las abejas a Varroa. Las conclusiones principales fueron : 1) la tolerancia de las abejas africanizadas de México a Varroa, ya que describimos por primera vez una disminución de la población de Varroa en esas colmenas ; 2) un tasa normal de fertilidad de las fundadoras, al contrario de todos los demás casos de tolerancia conocidos.

En la tercera parte, aquí mismo, analizamos los diversos factores susceptibles de explicar la tolerancia de las abejas africanizadas a Varroa (fertilidad de las fundadoras, duración de operculación, atractividad de la cría, limpieza de las abejas adultas, limpieza de la cría infestada).

1. Atractividad de la cría :

Como lo hemos visto anteriormente, el hecho de entrar en una celda de cría adecuada y al buen momento es, para una fundadora Varroa, una condición previa capital para su reproducción (ver parte 1, § 2). Parece existir un equilibrio entre la atractivad de las abejas adultas, con fin de diseminación, y la atractividad de la cría, con fin de reproducción. Un cambio en este equilibrio puede provocar un atractivad superior de la cría, y entonces la entrada de la fundadora en la celda. Al contrario, una cría poco atractiva puede limitar las posibilidades de reproducción para Varroa, y entonces explicar la tolerancia de algunas colmenas de abejas.

En nuestro caso, trabajamos directamente en las colmenas más bien que en condiciones controladas de laboratorio, con fin de probar la atractividad de la cría en condiciones lo más parecidas posible a las naturales. La idea básica es encerrar durante 24 horas algunas abejas cargadas de Varroa foréticas, sobre una zona de cría que contiene larvas viejas ; las abejas operculan entonces la mayoría de la cría, lo que permite determinar la proporción de ácaros que entran en la cría durante este tiempo. Idea sencilla, de cual el problema principal es fabricar una jaula a donde las abejas queden en contacto con las abejas de la colmena, sin que ni la primeras salgan, ni las segundas entren (ver fig. 1). Esta jaula tiene que ser completamente impermeable al paso de Varroa, a pesar de su pequeño tamaño (1.1 x 1.5 mm).

Figura 12 : plan de un panal de cria, con la jaula utilizada para medir la atractividad de la cria

Las dimensiones interiores de la jaula son fijadas en 4 x 4 cm, así cubriendo alrededor de 150 celdas de cría ; la altura es de 1 cm, lo que permite a las abejas del interior moverse libremente, y a las abejas del exterior desplazarse sobre la jaula, y así estar en contacto con las abejas del interior. Las paredes de la jaula deben medir al menos 3 cm de ancho, para cubrir varias celdas, lo que fue la única manera de impedir la salida de las Varroa, pero también de impedir que las abejas tuvieran tiempo para excavar abajo de las paredes en 24 horas de experiencia. El material utilizado para las paredes no puede ser madera, ya que su rigidez no le permite bien cerrar las celdas cubiertas ; el unicel, muy pronto despedazado, tampoco conviene ; finalmente el hule espuma conviene más, ya que cierra herméticamente las celdas cubiertas, y que las abejas no lo pueden despedazar. Esa jaula se cierra con una malla de plástico de 10 x 10 cm ; la malla, de 0.5 mm, impide el paso de Varroa. La jaula finalmente es fijada sobre el panal con dos ligas elásticas.

Para realizar la prueba, se escogen seis colmenas equivalentes en fuerza y en tasa de infestación (3 europeas y 3 africanizadas) ; 4 abejas se colectan en cada colmena. Por otra parte, se escoge una colmena híbrida fuertemente infestada por Varroa ; 10 abejas cargadas de una Varroa cada cual se colectan en esa colmena. Las 34 abejas y 10 Varroa así colectadas se guardan juntas una hora, en el laboratorio. Por otro lado, se colecta un panal con cría a punto de ser operculada en cada una de seis colmenas. Los 34 abejas y 10 Varroa se encierran en la jaula, sobre una zona que contiene un mínimo de 100 larvas viejas y algunas celdas llenas de miel. El panal es entonces colocado en su colmena de origen por 24 horas. Eso se repite en las seis colmenas.

Después de 24 horas se colectan nuevamente esos panales, para llevarlos al laboratorio. Se anestesian las abejas con CO2, luego se abren las jaulas, para contar el número de Varroa que se encuentran todavía sobre las abejas. El examen de las celdas de cría operculadas (entre 60% y 80% de la cría) permite verificar que las demás Varroa esten en la cría.

El examen de los resultados revela que las dos terceras partes de las Varroa entraron en la cría de abejas europeas, cuando una tercera parte permaneció forética (ver fig. 2). Al contrario, sóla una tercera parte de las Varroa entraron en la cría de abejas africanizadas, cuando las dos terceras partes permanecieron foréticas. Podemos concluir de este experimento que la cría de abejas europeas es dos veces más atractiva para Varroa que la cría de abejas africanizadas.

Figura 13 : proporción de Varroa entrando en la cria o demorando foréticas, durante la prueba de atractividad

Varios razones podrían explicar esta diferencia de atractividad. Las abejas y las Varroa dispuestas al interior de cada jaula se colectaron en las mismas colmenas, y entonces no pueden ser el origen de la diferencia. Al contrario, las abejas del exterior de la jaula, las ceras y las larvas operculadas al interior de las jaulas, son propios de cada colmena, particularmente de cada subespecie de abeja. Uno de los tres elementos (abejas, cera y larvas) o su combinación, ciertamente actúa para influenciar la infestación. Experimentos a base de intercambios entre colmenas, tras-larves o intercambios de cría, desde colmenas europeas hasta colmenas africanizadas (etc.) aportarían informaciones preciosas. A nivel de las larvas, estudios comparativos de las señales químicas darían elementos fundamentales para seguir nuestro estudio, para un mejor entendimiento de la biología de Varroa, y para una técnica de control de este parásito.

2. Duración de operculación :

Seguido se ha dicho que una corta duración de operculación sería un factor importante de la tolerancia. Sin embargo, el número medio de hijas adultas y fértiles por fundadora es ya restringido (en promedio de 1.2) ; un estudio reciente de la cronología del desarrollo de Varroa comprobó que solamente una duración de operculación reducida a menos de 10 días permitiría disminuir notablemente este promedio (ver parte 1, fig. 2). Como la duración de operculación regularmente es de 12 días, tal reducción parece muy improbable. Nos parecía sin embargo importante medir este parámetro.

El protocolo experimental consiste en seleccionar, en seis colmenas diferentes (3 europeas y 3 africanizadas), una zona de cría vieja de 40 cm2. Esta zona es marcada con una señal colorada en cada ángulo, luego fotografiada cada 8 horas ( a las 1h, 9h y 17h) durante 3 días. Diez días después de la operculación de la primera celda, las zonas de cría son nuevamente fotografiadas, cada 8 horas durante 3 días, con fin de determinar la hora de emergencia de las abejas. Ya que la apertura de las colmenas en medio de la noche es perturbadora para las colmenas, la fotografía de los panales se hizo en el apiario mismo, lo que fue realizable con ayuda de una lámpara eléctrica y un rollo de alta sensibilidad (ASA 1000).

El examen posterior de las fotografías permite determinar, para cada celda de cría observada, la hora aproximada de la operculación de la celda, y la hora de emergencia de las abejas ; la duración de operculación de la celda se puede entonces determinar, con una precisión de cuatro horas. Tanto las curvas de frecuencias acumuladas como los histogramas hacen aparecer una distribución muy similar de las duraciones de operculación de colmenas europeas y africanizadas (ver fig. 3). De hecho, el promedio de las duraciones de operculación es de 278.9 horas (o sea 11.62 días) en las colmenas europeas, contra 278.4 horas (o sea 11.60 días) en las colmenas africanizadas. La igualdad de la duración de operculación significa que este factor no puede ser responsable de la tolerancia de las abejas africanizadas a Varroa. Este resultado es conforme con la igualdad de composición de la descendencia de las fundadoras Varroa de los dos tipos de colmenas que se observó anteriormente.

No se pudo medir la temperatura de incubación de la cría, por falta de material adecuado. Sin embargo, se sabe que la correlación es muy fuerte entre la temperatura de la cría y la duración de operculación, lo que significa que la temperatura de incubación es equivalente en las diferentes colmenas. Es entonces claro que ni la duración de operculación de la cría, ni su temperatura, tienen importancia para explicar la tolerancia de las abejas africanizadas en México.

Figura 14 : curvas acumuladas (a la izquierda) e histograma (a la derecha) de las frecuencias de duraciones de operculaciÛn (en horas) de 451 celdas de abejas europeas y 484 celdas de abejas africanizadas

3. La limpieza de las abejas adultas :

Durante algunos años, se supuso que el factor determinante de la tolerancia de Apis cerana a Varroa era el comportamiento de limpieza de las abejas adultas. Sin embargo, se comprobó recientemente que el resultado principal de este comportamiento era que Varroa cambie de abeja, y no como se había sugerido inicialmente la eliminación de los ácaros por las abejas. En nuestro caso, la situación de coexistencia de abejas tolerantes y sensibles nos permitió verificar y cantificar la importancia de este comportamiento.

a. Comportamiento de las abejas

Las observaciones se hicieron en dos colmenas de vidrio que contenían un único panal (volumen interior : 50 x 35 x 5 cm). En cada colmena se introduce un panal lleno de cría de todos estadios (huevos, larvas, pupas y abejas naciendo), con alrededor de 2500 abejas y una reina. Uno se toma en una colmena europea, el otro en una colmena africanizada. Las dos colmenas se guardan dentro del laboratorio, un tubo transparente permite a las abejas de salir para pecorear ; el lado exterior del tubo se enreda con un papel de color, cual permite a las abejas de reconocer fácilmente su entrada. Una cobija mantiene las colmenas en la obscuridad, y se retira solamente durante el tiempo de las observaciones.

Por otra parte, un panal de cría fuertemente infestada se toma en una colmena y se guarda a la incubadora (32°C ; 70% HR), para que emerjan abejas cargadas de hembras Varroa adultas. Estas Varroa se colectan, se marcan con un punto de pintura para reinas, y se colocan nuevamente sobre las abejas durante 24 horas, lo que les permite perder el olor a pintura, olor capaz de señalarles a las abejas. Una hembra Varroa se colecta con un pincel fino humidificado, y se deposita por una pequeña apertura sobre una abeja de un de las colmenas de vidrio. El comportamiento de las abejas se observa durante los 8 minutos siguiente el depósito, tiempo dividido en seis periodos : 30"-1' ; 1'-2' ; 2'-4' ; 4'-6' ; 6'-8'.

La manipulación se repite diez veces consecutivas, en un tiempo total de 1h40. Dos horas después, los ácaros se buscan cuidadosamente sobre las abejas y en el fondo de las colmenas, para contarlos. El experimento se repite cinco veces, lo que involucra 50 Varroa por colmena. Los panales se colocan nuevamente en las colmenas originales, y se toman panales de otras colmenas. El triplicado implica a 150 Varroa para cada subespecie de abeja.

Durante cada periodo de observación, se buscan cuatro eventos :

un comportamiento de auto-limpieza (auto-grooming behavior) ; es decir, un cepillado por la abeja de su propia cabeza, de su tórax y de su abdomen, ayudándose con su primer y su tercer pares de patas ;

un comportamiento de alo-limpieza (allo-grooming behavior) ; es decir, una limpieza de la abeja por sus congéneres. Esas buscan activamente el ácaro, recorriendo todo el cuerpo de la abeja infestada con sus antenas. Nuestras observaciones no permitieron detectar un comportamiento de alo-limpieza tan activo como en el caso de Apis cerana. En esta especie, las abejas suben sobre la abeja infestada, hasta le abren sus alas para tratar de capturar Varroa con sus mandíbulas. En nuestros experimentos, las abejas recorrieron el cuerpo de la abeja infestada con sus antenas, cuando más, pero nunca capturaron el ácaro depositado ;

el cambio de huésped. Debido al comportamiento de las abejas, la hembra Varroa depositada pasa sobre otra abeja ;

la caída ! Todavía debido a este comportamiento, la hembra Varroa puede caerse de la abeja, comportamiento eficaz solamente si cae hasta el fondo de la colmena. En numerosos casos, sin embargo, ni este comportamiento es eficaz, ya que el ácaro caído logra a subir sobre una abeja junto a él.

Examinando los resultados (ver fig. 4), aparece que 80% de las abejas africanizadas tienen una reacción de auto-limpieza en los 30 segundos consecutivos al depósito, contra sólo 58% de las abejas europeas. Esta reacción va decreciendo a lo largo del tiempo, y casi no se puede observar después de 8 minutos en las colmenas europeas, 10 minutos en las africanizadas.

Figura 15 : comportamiento de 150 abejas de cada subespecie, durante 8 minutos siguiente el deposito de una fundadora Varroa, y resultado de este comportamiento. En ordenada se indica el porcentaje de casos en cuales se observa cada tipo de comportamiento

La alo-limpieza es casi inexistente durante el primer minuto después del deposito ; es decir, mientras la abeja está ocupada en limpiarse ella misma. Luego, incapaz de lograr su objetivo, la abeja estimula a sus congéneres con contactos antenarios ; las demás abejas se acercan entonces, y recorren el cuerpo con sus antenas. Durante el segundo minuto de observación, 57% de las abejas africanizadas tienen este comportamiento, contra 44% de las europeas. Como para el comportamiento anterior, la allo-limpieza va desapareciendo a lo largo del tiempo, y en pocos casos, se puede todavía observar al término de los 8 minutos.

El resultado de este comportamiento higiénico sobre Varroa se puede estimar en número de ácaros que cambian de abeja. De 150 Varroa depositadas, 57 cambiaron de huésped en las colmenas africanizadas, contra sólo 25 en las colmenas europeas. La mayoría de esos cambios ocurre en el segundo minuto de observación. En las colmenas africanizadas, sólo 15 de las 150 Varroa cayeron de las abejas al fondo de las colmenas, debido al comportamiento de las abejas, contra 9 de las 150 Varroa en las colmenas europeas.

En las colmenas europeas, dos horas después de los depósitos, aparece que 139 Varroa permanecieron sobre las abejas, 9 estaban muertas al fondo de las colmenas, 2 desaparecieron. En las colmenas africanizadas, 134 Varroa permanecieron sobre las abejas, 10 estaban muertas al fundo de las colmenas, 6 desaparecieron. Sólo 8% de las Varroa fueron definitivamente eliminadas por las abejas europeas, contra 11% por las africanizadas. Estos resultados indican que todas las abejas tienen un reacción inmediata al depósito del parásito, lo que se traduce por un comportamiento de limpieza, pero es más marcado en las colmenas africanizadas que en las colmenas europeas. Sin embargo, la eficacia en términos de eliminación permanece baja, en ambas subespecies de abejas.

b. Mutilación de los ácaros

Para confirmar esta baja eficacia del comportamiento de limpieza, 450 Varroa se colectaron en el piso de varias colmenas de cada subespecie, para observarlas con el estereoscopio. Se buscó toda mutilación eventual, debida al comportamiento de las abejas. Tres tipos de mutilaciones se distinguieron : ausencia de una de las patas del primer par ; ausencia del pretarso del primer par de patas ; presencia de mordidas en el idiosoma.

Figura 16 : proporción de Varroa muertas presentando un cuerpo intacto, o mutilaciones a los pretarsos del primer par de patas, al primer par de patas, o al cuerpo

El examen de los datos (ver fig. 5) revela que las mutilaciones se detectaron en proporciones similares en el pretarso 1, la pata 1 y en el cuerpo. Revela sobre todo que la gran mayoría de las fundadoras tienen su cuerpo intacto, tanto en las europeas (90.6%) como en las africanizadas (85.1%). Estos porcentajes, aunque significativamente diferentes, son inferiores al 30% de mutilación observado con Apis mellifera y Apis cerana en China.

Aunque el comportamiento de limpieza esté más marcado en las abejas africanizadas que en las europeas, es muy poco probable que el comportamiento de limpieza de las abejas adultas interfiera con la dinámica de las poblaciones de Varroa.

4. La limpieza de la cría :

Se conoce la implicación del comportamiento de limpieza de la cría infestada en lo tolerancia a Bacillus larvae y a Ascosphaera apis desde mucho tiempo, y es probable que tenga un cierto nivel de implicación en la tolerancia a Varroa. Para verificar esta hipótesis, hemos observado la cría operculada en condiciones de alta infestación. El experimento se realizó en noviembre ; es decir, en el periodo de máxima infestación de la cría. En seis colmenas de fuerza comparable (3 europeas y 3 africanizadas), una zona de cría de 140 cm2 que contenía muchas larvas viejas, es marcada con señales de color. La observación diaria de estas zonas de cría permite marcar la fecha de operculación de cada celda con una precisión de 12 horas.

Los experimentos anteriores nos enseñaron que la duración de operculación media es de 11.6 días. Durante los 10 días consecutivos de la operculación, las celdas marcadas se observan diariamente. Para las que ya no son operculadas, es decir que fueron abiertas por las abejas, determinamos : 1) el estado vital de la larva o de la pupa : es evidentemente muerta si está ausente de la celda, o si tiene señas de necrosis (aspecto traslúcido, color gris o negro), o señas de principio de limpieza por las abejas (cabeza o tórax faltantes) ; 2) el estado de infestación de la celda : es evidentemente infestada si las Varroa de cualquier sexo o estadio de desarrollo están presentes sobre la larva o sobre las paredes ; o si se ven acumulaciones fecales, de color blanco, sobre las paredes de la celda. Once días después de la operculación, todas las celdas son abiertas, para determinar si estaban infestadas o no. En total, 1706 celdas de cría de abejas europeas y 2367 celadas de cría de africanizadas fueron observadas.

El examen de los resultados (ver fig. 6) hace aparecer una mortalidad importante de la cría de europeas : 7% de la cría es muerta y limpiada por las abejas, contra 1.5% en las africanizadas. Esto se debe probablemente al hecho que Varroa es un importante vector de bacterias y virus de la cría, y a que la principal consecuencia de una tasa de infestación alta es ante todo una fuerte mortalidad de cría.

Figura 17 : proporción de cría limpiada por las abejas, durante los 10 días siguiente la operculación : cría muerta y cría viva no infestada en proporción de la cría total ; cría viva infestada en proporción de la cría infestada

Aparece también una tasa alta de cría aparentemente sana y aparentemente no infestada limpiada por las abejas : en total, 24% por las africanizadas, contra 17% por las europeas. Tres hipótesis pueden explicar lo que puede aparecer como pérdida : 1) a pesar de la ausencia de señas de enfermedades, la cría es detectada y limpiada durante el periodo de incubación viral o bacteriana ; 2) todavía a pesar de la ausencia de señas evidentes, la cría fue infestada antes la observación, y limpiada por las abejas, pero las fundadoras Varroa ya han salido al momento de la observación. Sin embargo, esta hipótesis podría explicar el exceso de limpieza solamente durante los tres primeros días, porque después, las acumulaciones fecales no pueden dejar alguna duda ; 3) las abejas detectan la infestación, pero con poca precisión, y no abren exactamente las celdas infestadas.

Finalmente, aparece que las europeas limpian alrededor de 8% de la cría infestada, es decir cuatro veces menos que las africanizadas, quienes limpian 32% de la cría infestada. Como, además, la tasa de infestación era dos veces más baja en las colmenas africanizadas que en las europeas, lo que significa que la cría infestada era dos veces más difícil para encontrar, entonces aparece toda la dificultad del comportamiento de limpieza de la cría. Se podría oponer que la cría es abierta "al azar", pero eso haría aparecer una cantidad tres veces más importante de cría abierta "por error" que de cría abierta a propósito. Se puede entonces concluir que las abejas africanizadas detectan y limpian una tercera parte de la cría infestada, cuando las abejas europeas sólo limpian una décima parte.

Se necesitan experimentos complementarios para definir si la apertura excesiva de cría sana por las abejas europeas resulta de errores por parte de las abejas. El uso de una técnica de infestación artificial de la cría por un número exacto de fundadoras Varroa permitirá controlar que la cría limpiada coincida precisamente con la cría infestada.

5. Conclusiones :

Dieciocho meses de estudios en México nos permitieron sacar varias conclusiones en cuanto a los fenómenos de tolerancia natural de las abejas a Varroa. Estos estudios no son para nada desconectados de la realidad de terreno de la apicultura de producción, ya que su objetivo es un perfecto conocimiento de las relaciones abeja-Varroa, que permitirá poner a punto una técnica de control a la vez eficaz, de largo plazo, y respetuosa de las abejas y de sus productos.

Ahora sabemos que las abejas africanizadas en México son tolerantes a Varroa ; esta tolerancia no aparece todo el año, ya que un desarrollo importante de la poblaciones de Varroa es seguido de una diminución de estas poblaciones. Al contrario de todos los demás casos de tolerancia conocidos, la fertilidad de las fundadoras Varroa en ningún caso puede explicar nuestro caso de tolerancia.

El estudio de los factores de tolerancia nos permite concluir que la cría de abejas africanizadas es dos veces menos atractiva para Varroa que la cría de abejas europeas ; eso constituye la primera vía de investigación mayor. Al contrario, la igualdad de la duración de operculación en todas las colmenas observadas parece confirmar el poco futuro de la selección de colmenas con una corta duración de operculación. Igualmente, el comportamiento de limpieza de las abejas africanizadas, a pesar de su intensidad, es poco fructífero, y predice poco éxito para las investigaciones cuyo objetivo es seleccionar abejas que tengan un comportamiento de limpieza marcado. Finalmente, el comportamiento de limpieza de la cría infestada por las abejas africanizadas parece ser de real eficacia ; constituye una secunda vía de investigación mayor.

6. Perspectivas :

Hoy en día, se está empezando un nuevo programa de investigación, todavía en México, cuya base sigue siendo una comparación entre abejas europeas sensibles a Varroa, y abejas africanizadas tolerantes. De una duración de dos años, los objetivos de este nuevo trabajo son : 1) buscar las bases químicas de la atractividad de la cría ; 2) buscar las bases químicas y de comportamiento de la limpieza de la cría infestada ; 3) colectar muestras de abejas a lo largo de todo México, para confirmar la hipótesis (no expuesta aquí) de un doble gradiente hibridación de abejas / tolerancia a Varroa ; 4) buscar las bases genéticas de los factores de tolerancia a Varroa. Este ultimo objetivo, de importancia mayor, es de gran amplitud, y rebasará seguramente el cuadro de dos años impartido a nuestro programa actual. Sin embargo, constituye muy probablemente el futuro de la lucha contra Varroa jacobsoni y de la preservación de nuestras abejas.